摘要

暴露于多种物质是风险评估的一个挑战。目前，是否应该引入通用的“混合评估/分配因素”(MAF)以加强公共卫生保护正在进行辩论。在这里，我们探讨混合毒性的概念和混合调节概念对人类健康保护的潜在影响。基于这一分析，我们提出了研究和风险评估的建议。混合毒性的概念之一是可加性。物质可通过影响共同靶细胞内的相同分子机制而叠加起作用，例如，二恶英样物质。在第二个概念中，“增强物质”可以通过增加靶部位浓度和加重“驱动物质”的不利影响来起作用。对于这两个概念，对单个物质进行充分的风险管理可以可靠地防止对人类的不利影响。此外，我们还讨论了一种假设，即人类以非常低的个人安全剂量接触的大量物质可能相互作用，造成不利影响。本评注指出了知识上的差距，例如缺乏对受不同领域管制的物质(包括食品、环境和职业相关物质)的全面概述，缺乏可靠的人体暴露数据，以及无法获得目前人体暴露于阈值的比率，这些阈值被认为对个别物质是安全的。此外，需要对分子机制和最易感靶细胞进行全面的概述。我们的结论是，目前没有科学证据支持需要通用MAF。相反，我们建议采取更具体的措施，将重点放在人体暴露与剂量之间比例相对较小的化合物上，在这种情况下，可能会产生不良影响。

介绍

人类接触到大量的物质，包括那些有意或无意形成的人造物质，以及天然存在的化合物。这些物质存在于我们的食物、环境和工作场所中(Huhn et al. 2021)。虽然对单一化合物的风险评估已经建立，但同时接触多种物质对风险评估和基础毒理学研究来说是一个挑战。暴露于多种物质所引起的毒性被称为“混合毒性”(Sarigiannis和Hansen 2012;肖2014)。重要的是要了解不同物质在同时存在于人体内时是如何作用和相互作用的，以及这种相互作用是否会影响毒性作用。与单个成分的毒性相比，它们可能共同导致加性或甚至超过加性(协同)效应(Delfosse et al. 2021;Elcombe et al. 2022)。

最近，由于担心物质混合物可能会对人类造成未知或升高的已知毒性，人们开始讨论如何解释混合物成分的潜在综合效应(Tralau et al. 2021)。通用的“混合物评估/分配系数”(KEMI 2021)由瑞典(KEMI)和荷兰(RIVM)欧盟成员国当局提出作为风险管理措施，并由欧盟委员会在“欧盟化学品可持续发展战略”(欧盟委员会2020)中采纳。通用MAF可将可接受暴露限值(AEL)降低2、5或10倍。AEL通常被确定为风险特征比(RCR)/风险商(RQ)，即个人暴露与基于健康的指导值(HBGV)之商，如每日可接受/可耐受摄入量(ADI/TDI)或衍生的无影响水平(DNEL)，代表假定不会对人体造成不良影响的最高剂量。与特定的数据驱动方法相反，通用MAF平等地适用于人类接触的所有物质，而不管其个人可能导致混合效应。然而，在实施无针对性和普遍性的措施之前，应探索混合毒性的科学证据、机制合理性和不确定性。

在目前关于混合物毒性作用的辩论中，由于现有的实验数据不具有结论性，有时很难区分已确立的概念和尚未得到证实的假设。为了便于讨论，我们首先描述物质相互作用的既定机制。为了更好的识别，我们将这两个概念命名为“多头龙”和“恶的协同”。在“多头龙”的概念中，以龙的头为标志的几种物质通过相同的机制或在相同的分子关键事件中聚集的机制起作用，导致对相同的生物靶点(例如某种细胞类型)的作用。在“邪恶的协同”概念中，一种物质增强了另一种物质的毒性作用。这可能是因为参与代谢解毒的酶或负责物质排泄的转运蛋白受到抑制，导致物质浓度增加(毒性动力学“邪恶的协同作用”)。此外，不同的机制(其关键事件没有重叠)可能会间接地相互增强(毒理学的“邪恶协同”)。我们还研究了一种普遍的假设，即人类以非常低的、对个人无害的剂量暴露于大量物质中，这些物质会混合起来造成不利影响(Dinca et al. 2023)。我们将这一假设命名为“反抗侏儒”假说。根据现有数据，我们得出结论，哺乳动物和人类的混合毒性(如果适用)在很大程度上遵循“多头龙”概念，并讨论了对在相关暴露持续时间和关键时间窗口内以相关暴露浓度存在时可能起加性作用的物质进行分组的条件。我们进一步得出结论，目前既没有实验证据，也没有合理的机制来支持“反抗侏儒”假说。因此，也没有必要采取通用的保护措施，以防止极低水平的多种化学品接触对健康的影响。相反，我们强调需要进一步发展和完善目标混合物毒性评估的概念。

毒性作用的阈值风险的概念个别物质的估价

毒理学的一个基本假设是物质的副作用是剂量依赖的。与较高剂量相比，较低剂量的物质对特定生物体的毒性较低或没有毒性。没有这个，生命就不可能存在，因为它不断面临化学挑战，无论是来自天然物质还是合成物质。因此，毫不奇怪，所有生物都将其生物化学的重要部分用于内源性和外源性有害物质的代谢、排泄和失活(Monosson 2012)。特别是关于食物，应该指出的是，我们的日常饮食通常由含有过多物质的复杂混合物组成，众所周知，这些物质具有有效的代谢解毒作用。如果没有这种覆盖广阔化学空间的高效机制，许多物质将表现出更高程度的毒性。根据我们对机械原理的理解，在特定剂量以下不会出现不良反应。这一假设的分子基础是，在一定浓度以下，毒性物质与其生物靶点的相互作用是可以忽略不计的，或者对于不可逆的相互作用，在一定的累积浓度以下。一个例外是具有直接遗传毒性作用方式的致癌物，其不发生致癌性的剂量可能非常低且难以确定(Bolt等人，2004;Hengstler et al. 2003;Nohmi 2018)。然而，应该指出的是，现在有越来越多的讨论表明，通过基因毒性和诱变机制起作用的药物也可能表现出非线性的剂量-反应关系，从而可以建立一个阈值(Guth等人，2023;Hartwig et al. 2020)。然而，人们普遍认为，至少在理论上，对于所有其他不良影响，存在一个可识别的暴露阈值，低于这个阈值就不会发生不良影响。

在剂量依赖性动物实验中，通常确定两个值作为风险评估的所谓"出发点":未观察到的不良影响水平(NOAEL)，即在该实验中未造成不良健康影响的最高剂量，以及观察到的最低不良影响水平(LOAEL)，即在体内观察到可测量的不良影响的最低剂量。对于经口服途径暴露的物质，这两个参数通常以mg/kg体重/天(mg/kg体重/天)表示(图1)。对于大多数物质，NOAEL和LOAEL来源于对啮齿动物的亚慢性或慢性研究。在数据可用的情况下，noael和loael也可能来自人类流行病学或临床研究。

个别物质风险评估原则。DNEL，衍生无效应水平;每日可接受摄入量;TDI，每日可耐受摄入量;OEL，职业暴露限值;BMDL:基准剂量下置信限;NOAEL，未观察到不良反应水平

基准剂量(BMD)模型已应用于监管毒理学，以提供更可靠和客观的阈值推导方法。它考虑了整个剂量-反应曲线，同时参考了定义的临界效应大小并考虑了衍生PoD中的不确定性。通常，这是通过使用BMD下限(BMDL)而不是BMD本身来反映的。平均而言，基于BMD和noael的方法通常会产生可比较的pod，尽管在个别情况下可能存在实质性差异，例如在一个数量级内(EFSA Scientific Committee et al. 2022)。因此，已经导出的NOAELs可以保留，但应根据EFSA建议的BMD方法在物质重新评估后进行审查。

在风险评估中，像BMDL或NOAEL这样的pod可以决定授权和安全使用水平。然而，暴露量和阈值的估计都有不确定性。观察到的pod显然取决于所进行测量的灵敏度，不能保证所进行的测试涵盖了化合物的所有相关健康影响。因此，人类的接触量应该只占PoD的一小部分。考虑到安全数据和接触条件的不确定性，确定基于健康的指导值(hbgv)有不同的方法，这些指导值代表人类接触一种预计不会造成明显健康风险的物质的最大接触量。hbgv的例子有DNEL、ADI/TDI和职业暴露限值(欧盟委员会2018年)。为了推导hbgv, PoD通常由一个综合评估因子(OAF)和一组个体评估因子(AFs)来划分，例如，考虑物种间或人类种内变异性(Dourson et al. 1996;欧洲食品安全局科学委员会2012;雷曼和菲茨休1954年;世界卫生组织，2009;世界卫生组织等，1987年)。从历史上看，在他的情况下，OAF是100的常规应用，但偏差是可能的(在较高和较低的方向上)，例如，取决于动物实验中使用的物种或物质特异性AF是否可用。最近，这一概念得到了进一步扩展，除其他外，通过实施法规(EC) 1907/2006 [REACH法规(欧盟委员会2006年)]下的异速缩放概念，或通过将AFs表示为分布而不是点估计(Chiu and Slob 2015;世界卫生组织和国际化学品安全规划(2018年)，以实现概率危害和风险特征。

有限公司几种物质如何在混合物中相互作用而引起不良影响的概念

主要有两个值得关注的概念可以解释混合物中的物质如何相互作用，从而增加其各自成分可能引起的不良影响。在本文中，我们以“多头龙”和“恶的协同”的名义对这些概念进行了进一步的探讨。

有限公司“多头龙”的概念

如果混合物中的物质在相同的靶细胞中以相同的分子机制起作用，则它们可能表现出毒性的累加效应，即使它们存在于各自的hbgv以下，因此被认为是单独安全的(图2A)。我们把这个概念称为“多头龙”:导致受伤的机制——这里以龙头为象征——成倍增加，创造出更危险的龙。在毒理学中，这一原则得到了充分的证明，例如，对于多氯二苯并对二恶英(pcdd)、多氯二苯并呋喃(pcdf)和多氯联苯(pcb)，所有这些主要通过激活芳烃受体(AhR)引起不良影响(Beischlag等人，2008;Bradshaw and Bell 2009;Fernandez-Salguero et al. 1996;Gonzalez and Fernandez-Salguero 1998;Peters and Gonzalez 2011;Peters et al. 1999)。对于这些物质，可以使用毒性当量(TEQs)来评估混合效应，TEQs表示一种物质的毒性占该类型中毒性最大物质的一小部分(1998年安全)。每种化合物都被分配一个毒性等效系数(TEF)，根据其毒性最强的同系物(例如2,3,7,8- tcdd)对其毒性进行评级，其中TEF最高为1.0。为了评估这些化合物的混合效应，将单个物质的浓度(Ci)乘以它们的单个TEF (Ci × TEF)，并计算所有Ci × TEF的总和。应该指出的是，二恶英类物质也可能通过不依赖ahr的机制起作用(Neumann 1996;Peters and Gonzalez 2011;安全1997)。然而，根据多头龙的概念，它需要通过相同的机制进行活动，它们与该化合物类中的混合效应无关。此外，一些多氯联苯、多氯联苯和多氯联苯的作用可能小于相加性，因为在这种风险评估方法中没有考虑毒性动力学和生物利用度(Peters and Gonzalez 2011;安全1997)。

混合毒性的概念。A多头龙。B邪恶的协同作用

在评估二恶英类化合物以外的化合物群(如全氟烷基物质)的混合毒性方面，也讨论了TEF方法，尽管这种方法仍然具有挑战性(Peters和Gonzalez, 2011;Scialli et al. 2007)。有两类全氟烷基物质:全氟羧酸(PFCAs)和全氟磺酸(PFSAs)，它们被怀疑会引起肝毒性、发育毒性、免疫毒性和肿瘤发生(Colnot和Dekant, 2021年;工藤和川岛2003;Lau et al. 2007, 2004)。然而，与主要通过单一受体引起不良反应的二恶英样物质相反，AhR、PFCAs和pfsa可能通过多种核受体起作用，包括PPARα、PPARγ、PPARβ/δ、CAR、PXR、肝X受体α和ERα (Fenton等人，2021;Peters and Gonzalez 2011)。这导致了一个复杂的情况，因为它是不够清楚的，通过哪些受体个别物质引起不良反应，或这些受体如何定量地相互作用。此外，个体PFCAs和pfsa表现出毒性动力学差异，不同程度的种间变异性和针对不同组织(Peters和Gonzalez 2011)。因此，发展全氟烷基物质的TEF概念似乎很困难。

建立全氟烷基物质的TEF概念的一个先决条件是建立一个数据库，其中载有关于个别全氟烷基物质对上述受体和受影响组织的激活程度的信息。这个概念可以扩展到其他物质，如三唑类杀菌剂。最近有研究表明，其中两种杀菌剂丙环康唑(propiconazole)和戊康唑(tebuconazole)以浓度递增的方式作用于药物代谢相关基因(如CYP3A4)的RNA表达(Knebel等，2018)。然而，仅暴露于这两种物质是复杂的，因为一些影响可能是相加的，如CYP3A表达，而一些拮抗作用，如CAR激活(Knebel et al. 2018)。这些发现表明，混合物中物质的加性效应的可能性将随着它们作用于不同分子靶点的数量以及由于毒性动力学的差异而受到影响的不同细胞类型和组织的数量而减少(EFSA科学委员会等人，2021)。此外，暴露于混合物组分需要相对恒定，至少跨越一个临界时间窗口，被认为与潜在的混合效应相关。

对于终身暴露，在某些情况下报告了超过加性效应(Dinca et al. 2023)。这些研究的证实和机理细节需要进一步的研究。基于对不同化学物质可能影响生物学中相似过程的认识，欧洲食品安全局提出了累积评估小组(CAG)的概念。一个例子是“影响神经系统运动分裂”的杀虫剂(van Klaveren et al. 2021)。该CAG中许多农药对乙酰胆碱酯酶有抑制作用。因此，它们影响相同的分子靶点和信号通路。然而，也有完全不同的目标，如钠通道，在其他细胞或身体部位，影响运动行为。这说明CAG最初的概念不是分子定义的，而是以生物学功能或病理观察为出发点。后一点以肝毒物CAG为例，例如，肝毒物包括触发肥厚或脂肪变性的化合物组(Colnot et al. 2020)。另一个例子是指颅面畸形或神经管缺陷的CAG (European Food Safety Authority et al. 2022)。许多不同的靶点和细胞类型可能涉及这些病理。随着CAG概念的进一步发展，它将包括更多的病理(例如肾毒性)和更多的分子细分(欧洲食品安全局等人，2019)。当有足够的关于病理终点和相关目标通路的关系的信息时，可以预期cag可能与不良结局通路(AOP)或目标通路有关。脂肪变性或神经管缺陷的例子表明，许多分子靶点和信号通路可能会聚在一个给定的病理上。这也意味着影响这种通路网络不同部分的化合物在理论上可能对最终的不良结果产生加性(或协同性)作用。

有限公司“恶的协同”概念

毒物动力学“邪恶的协同作用”。最常观察到的协同作用类型是毒性动力学的“邪恶协同”，其中称为“驱动剂”的一种物质或物质混合物的毒性作用可能被称为“增强剂”的第二种物质(或混合物)增强(图2B)。例如，当增强剂减少驱动物的代谢失活或排泄导致在作用部位存在更多驱动物的情况时，可以观察到协同作用。因此，如果驱动剂作为单一物质的剂量已经高于LOAEL，则驱动剂引起的毒性将被增强剂增加。如果驱动剂(作为单一物质)的剂量低于HBGV，如图2B所示，原则上，添加增强剂可以增加生物体中驱动剂物质的浓度，从而超过效应阈值。当增强物质诱导负责驱动物质代谢激活的酶时，进一步的情况会导致“邪恶的协同作用”。

最近发表的毒性动力学“邪恶协同”的一个例子是真菌毒素赭曲霉毒素A (OTA)与非特异性泛细胞色素P450 (CYP)抑制剂1-氨基苯并三唑(ABT)的联合暴露(de Montellano 2018)(图3A-D)。OTA的主要作用机制之一是诱导氧化应激(Ghallab et al. 2021;Hassan等人。2022a;Kőszegi和Poór 2016;Mally and Dekant 2009;Ringot et al. 2006;Tao et al. 2018)。此外，已知OTA可被CYP酶解毒(Hassan et al. 2022a)。在本研究条件下，单独使用OTA仅能引起血清丙氨酸转氨酶(ALT)活性的轻微升高，ALT是肝毒性的标志。组织学分析显示弱肝毒性的迹象，中央静脉周围个别肝细胞坏死。相比之下，在Hassan等人使用的剂量下，单独使用ABT对肝毒性没有影响(2022b)。然而，联合暴露于OTA和ABT引起的肝毒性作用比单独暴露于OTA强几个数量级，如血清ALT和天冬氨酸转氨酶(AST)活性的大量增加以及整个肝小叶中心周围区坏死(图3B-D)所证明的那样。这个例子说明了“邪恶的协同”的一个重要特征:协同作用发生在两种不同的机制之间。在毒性动力学“恶的协同”的情况下，两种物质中的一种作为驱动(这里，OTA通过诱导氧化应激)，另一种作为增强(这里，ABT通过抑制CYP起作用)。与驱动因子相反，暴露于增强因子必须超过其作用阈值，从而引起CYP的抑制，从而产生协同作用。这并不意味着在这个剂量下，增强剂一定会引起不良反应，如组织损伤或细胞死亡。如果ABT的暴露量低于抑制剂量，整个“邪恶的协同作用”就会崩溃，OTA的毒性不会增加。然而，如果OTA的剂量低于产生活性氧的阈值，原则上，与增强剂联合使用可能会使组织中的OTA浓度高于发生不良反应的临界水平。因此，从监管的角度来看，重要的是增强剂保持在增强机制活跃的剂量以下，以保证不会发生“邪恶的协同作用”。然而，动力学相互作用模式，如CYP抑制，尚未常规考虑BMD或NOAEL衍生。目前混合物风险评估中忽视了物质的潜在增强特性。缺乏系统的物质筛选各自对代谢或主动运输的抑制潜力或低浓度下动力学相互作用的总体影响仍然是一个应该在未来解决的数据缺口。

两种物质在小鼠实验中的协同作用的例子(来自Hassan et al. 2022a, b)。A驱动剂(赭曲霉毒素A)和增强剂(1-氨基苯并三唑)物质的剂量;B暴露小鼠肝脏肉眼病理;C组织学分析;D血清丙氨酸转氨酶(ALT)活性测定

关于OTA和ABT的协同作用，应该考虑到在上述例子中使用的OTA剂量(7.5 mg/kg bw)是为了说明联合暴露于CYP底物和抑制剂的原理(Hassan等，2022b)，尽管已知人类暴露量要低得多。据报道，欧洲人口暴露的第95百分位数上限仅为0.013微克/千克体重/天。即使是强增强剂也不太可能将驱动因子的组织浓度提高几个数量级。

人类暴露于CYP抑制剂是可能的。例如，在葡萄柚汁中发现的各种呋喃香豆素是CYP3A和其他cypp同工酶的有效抑制剂，在许多药物或化学物质的代谢中起着核心作用(Girennavar等人，2007;SKLM 2004)。饮用典型量的葡萄柚汁可能会增加某些药物和化学品的生物利用度/最大血浆浓度或消除半衰期，因此在患者信息表中包含相应的警告(SKLM 2004)。有共识认为，人类暴露于植物成分的剂量，导致CYP抑制应避免。

毒物动力学“邪恶的协同作用”。毒物动力学“邪恶的协同作用”描述了一种物质被另一种物质间接增强的效果，没有物质共享毒物动力学机制或相互作用动力学。虽然在概念上令人信服，并且在药理学上众所周知(治疗和不良副作用)，但目前很难确定两种或两种以上的物质在实验上被证明对人类的毒性动力学“邪恶协同作用”负责的例子。急性慢性肝损伤似乎符合这些标准。慢性暴露，例如酒精，导致肝细胞更容易受到某些肝毒性药物的急性暴露。尽管如此，这种形式的药物性肝损伤的几个方面仍然没有得到充分的了解(Zaccherini et al. 2021)。

在动物实验中，研究了多氯联苯(PCBs)和高氯酸盐(ClO4−)可能的相互作用(McLanahan等人，2007年)。两种化合物通过不同的机制诱导甲状腺功能减退。本研究中使用的PCB同系物(PCB126)已知与AhR结合，在肝细胞中诱导尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(udpgt)，并增加甲状腺素葡萄糖醛酸的胆汁排泄，从而可能导致甲状腺功能减退。ClO4−抑制碘吸收进入甲状腺，从而减少甲状腺激素的产生。当大鼠在给予ClO4 -之前暴露于相对高剂量的PCB126时，ClO4 -剂量-反应曲线向右移动，显示出联合效应。然而，综合效应小于相加效应(McLanahan et al. 2007)。当大鼠暴露于PCB126和ClO4 -的剂量下或接近每种化合物的NOAEL时，没有观察到对甲状腺指数的这种联合影响(McLanahan等人，2007)。多氯联苯-高氯酸盐效应的例子说明，由于多氯联苯诱导T4的代谢和排泄，从而加重了高氯酸盐的作用，毒物动力学和毒物动力学之间可能存在“恶的协同”的边界情况。然而，本研究定义的典型毒性动力学“恶的协同作用”要求增强物质增加毒性靶细胞中驱动物质的浓度。相比之下，在多氯联苯-高氯酸盐的例子中，两种不同的机制在同一关键事件(即T4水平降低)上汇合，而每种物质都不影响另一种物质的浓度。

在小鼠中观察到的另一个例子是，抗生素可能导致肝脏中微生物介导的胆汁酸合成负反馈控制的丧失。这种负反馈的丧失导致肝胆汁酸浓度的增加，进而导致胆管屏障功能的破坏，从而导致致命的肝损伤。致死性肝损伤的一个先决条件是其他因素，例如毒性机制已经导致胆汁淤积(Schneider et al. 2021)。然而，应该考虑到人类和老鼠之间存在着巨大的差异。Farnesoid X受体(FXR)介导的胆汁酸合成负反馈机制在人肝细胞中比在小鼠肝细胞中更有效。

在最近的另一项研究中，将斑马鱼胚胎暴露于8种物质中3天，这些物质被选中是因为它们单独或通过不同的机制组合在一起导致斑马鱼胚胎颅面畸形。所有8种物质在单个NOAEL处的联合作用导致颅面畸形，其联合作用比单个物质更强。然而，尽管这八种化合物可能作用于不同的分子靶点，但它们的不良机制仍可能会聚在下游靶点，诱发颅面畸形(van Der Ven et al. 2022)。据我们所知，复杂的混合物代表现实的组合人体暴露还没有实验研究。

由于足够的体内研究的可用性有限，在一个共同的关键事件中，如线粒体毒性、氧化应激或细胞内胆汁酸浓度的积累，通过机制聚集起作用的物质是否应该在毒性动力学“邪恶协同”或“多头龙”的概念下被视为存在争议。未来的研究可能会回答这个问题，是将“多头龙”概念限制在完全通过相同机制起作用的物质上更合适，还是将其开放到在特定关键事件上汇聚的物质上更合适。正如欧洲食品安全局CAG概念所表明的那样，这些概念可能存在一定的重叠，或者我们还没有充分了解影响复杂网络不同节点的化合物如何共同作用以产生共同的不利影响(Goodson III et al. 2015;Miller et al. 2017)。

“反抗的矮人”假说

毫无疑问，人类不断接触到复杂的混合物，即在食物中或通过环境和职业接触接触到低于HBGV水平的极低剂量的多种物质(Escher et al. 2020)。其中许多物质在人体内只能检测到微量。在这里，我们将“矮子”定义为混合物中存在的物质低于其单独的HBGV，因此人类接触的PoD低于OAF。单独来看，这些低剂量物质都不会造成不良影响(图4)。根据“令人反感的侏儒”假说，尽管这些物质的剂量很低，但由于它们的数量众多，它们可能会因亚加性、加性或协同性活动而对人类造成不良影响。虽然不是以“令人作呕的小矮人”的名义，但这个基本想法在毒理学领域已经存在了一段时间，尽管有一些谨慎的注意，因为所有这些物质确实需要同时或紧密连续地出现在它们的目标上。这种在目标地点同时暴露的要求限制了这一概念的适用性，特别是在陆生生物中。这一概念最近再次被提出，例如Baumer等人(2021)和Escher等人(2021)。因此，作者假设“单个污染物可能以非常低的浓度存在，远远低于预期的任何浓度，但在混合物中共同作用，其生物活性可能导致可检测的影响”(Escher et al. 2021)。

反抗侏儒的概念

在设计的混合实验中结合这些“小矮人”来探索是否观察到加性效应是实用的，原则上也很容易适用。然而，需要注意的是，如果假设个体“矮子”在PoD/OAF值下的相对效价比相同，那么使用这种方法在实验上研究混合物有很大的局限性。换句话说，它从PoD线性外推到HBGV，而实际上，剂量-反应关系的各自部分可能根本不是线性的，在HBGV处引起效应的剂量实际上可能高于或低于HBGV。

然而，问题仍然存在，如果这些小矮人在单独无害的暴露水平下共同作用，是否会造成不利影响。“令人厌恶的侏儒”假说已经在一些动物实验中得到证实。在一项具有历史意义的研究中，伊藤和同事们让老鼠通过饮食接触20种农药(19种有机磷和一种有机氯物质)。每一种农药都按其各自的推荐摄入量使用(Ito等，1995年)。作者在一个8周的暴露模型中研究了n -亚硝基二乙胺在肝脏中引发的肿瘤前病变的形成。这一终点是相关的，因为据报道或怀疑高剂量的某些测试物质，如马拉硫磷或甲基硫磷具有肝癌致癌性(Ito等，1995年)。重要的是，这20种农药的混合物在他们的ADI没有增强肿瘤前病变。在第二项实验中，将40种代表高产化学品的农药或20种疑似致癌性的农药按各自的每日推荐摄入量添加到饮食中，并通过多器官28周致癌性方案进行测试(Ito et al. 1995)。混合物对任何器官都没有致癌作用。因此，这40种物质在单独无害的剂量下，在大鼠分析的终点上不会共同产生不良反应。从理论上考虑，以同样低的剂量组合更多的物质，以了解需要多少物质才能观察到不利的混合效应，这将是有趣的。另一方面，在Ito等人(1995)的研究中，人类极不可能同时暴露于40种农药，其剂量与大鼠相同。

许多其他研究解决了使用不同混合物的共同暴露的相关性，包括体内读数(例如Elcombe等人，2022;Heise et al. 2018;Houtman et al. 2014;Ma et al. 2023;Perez-Carreon et al. 2009;Rieke et al. 2017;山姆和琼斯2011;Schmidt et al. 2016)。一些研究在各自的分析中使用了NOAEL物质的组合。一个重要的问题是，今后对混合物的研究应满足哪些标准。需要进行研究，测试能够代表人类实际接触到的混合物。一种可能的方法是确定人类对“矮化”化合物的暴露，并在当前暴露水平和实验动物中按比例增加的暴露水平下测试这些混合物。另一种方法是根据PoD确定混合物中的单个剂量(测试例如1/3、1/10、1/30、1/100的PoD组合)，以了解组合效应在实验动物中是亚加性、加性还是高于加性。在这种类型的实验中，使用相同的暴露条件和读数来生成单个物质(除了混合物)的可靠数据，以保证单个物质和混合物之间的可比性，这一点也很重要。此外，需要考虑人类和试验动物之间的物种差异。在体外进行类似的实验应该考虑到相关的动力学过程，例如通过进行PBTK建模(Ma et al. 2023)。或者，可以使用基于全混合物的体外策略来测试复杂的“现实生活”混合物，正如目前在绿色交易项目PANORAMIX中所探索的那样(Escher et al. 2022)。

目录

按“累积评估小组”(CAGs)分组

正如在“多头龙”概念下所讨论的那样，在共同靶细胞中以相同机制作用的物质可能会产生加性效应。CAG的概念更进一步，如果物质属于一个共同的“累积评估组”(CAG)，那么它假定了加性效应，其中CAG通常指的是共同的靶器官病变(Boberg等人，2021;EFSA科学委员会等，2019;欧洲食品安全局科学委员会等，2021;van den Brand et al. 2022;Wohlleben et al. 2023)。对于保守的第一层评估来说，这个概念可能是合理的，例如出于优先级的目的。然而，考虑一个共同的器官来评估化学混合物的危害，而不进一步细化，太过笼统，不能实际假设加性效应。有几个例子表明，这一概念需要进一步细化到目标分子或目标途径的水平。器官毒性，例如肝毒性，可能由多种机制引起，例如几种核受体的激活(Knebel等人，2018)，脂质代谢的改变(Brecklinghaus等人，2022a)，线粒体毒性(Ghallab等人，2019;Pessayre et al. 1999)，蛋白质或脂质结合(Agarwal et al. 2012;Sezgin et al. 2018)，以及肝细胞或胆管细胞携带者的抑制作用(Brecklinghaus et al. 2022b;Ghallab et al. 2022;Remetic et al. 2022)等。由于多种可能的机制，按目标器官进行可加性分组总是需要包括机制方面的考虑。

此外，基于特定病理(如胆汁淤积)的加性效应分组原则(Boberg et al. 2021;Foster et al. 2020)可能太粗糙了。虽然比简单地根据目标器官分组更具体，因此代表了合法的，稍微不那么保守的第二级评估，但同样地，根据病理分组也太不具体了。对于胆汁淤积的例子，应该考虑到胆道是复杂的，在小管网络、小叶间管和大管中可能有不同的机制活跃(Jansen et al. 2017;Vartak et al. 2021b)。许多载体协调胆汁酸和其他有机溶质从血窦进入肝细胞的摄取。相反，其他携带者组负责从肝细胞分泌到胆管(Vartak et al. 2021a)。几种机制控制胆管细胞的水分泌，包括cAMP-、PKA-和ip3依赖机制(Vartak et al. 2021a)。此外，炎症过程可能会导致胆管阻塞，而其他炎症过程会损害肝细胞极性，从而影响通过胆管进行胆汁引流的效果(Vartak et al. 2016)。这个病例作为一个例子说明，即使是一个常见的病理，如胆汁淤积，可能仍然太模糊，无法确定物质将起作用。相反，例如，当同一载体被两种或两种以上物质抑制时，可发生加性效应。一个被充分研究的例子是抑制小管胆汁盐分泌载体BSEP (breclinghaus et al. 2022b)。当某种物质抑制BSEP时，肝细胞向胆管分泌胆汁酸减少，这可能导致肝细胞胆汁酸浓度高于细胞毒性阈值。几种抑制BSEP的物质可能会共同起作用。与欧洲食品安全局最新的分组指南一致，这些考虑表明，对于可能的加性效应，共同的分子机制是最可靠的分组原则，正如前一节中对核受体的类似讨论(欧洲食品安全局科学委员会等人，2021)。

分成共同动力群(ckg)

经典分组的另一个限制是对动力学相互作用的忽视。正如上文对OTA和ATB的解释，破坏有毒物质的代谢清除可能会增加其在靶组织中的浓度，从而产生不良反应。此外，抑制主动外排或诱导主动摄取转运蛋白也可能影响物质的毒性(Braeuning et al. 2022)。在基于物质的风险评估和阈值推导中，没有考虑这种相互作用模式，并且仍然是混合物毒性的数据缺口。因此，Braeuning等人(2022)提出根据诱导或抑制代谢酶和活性转运蛋白的能力对物质进行分组。此外，还需要更多的研究来了解溶剂和表面活性剂对有毒物质被动转运到目标部位的影响(Karaca et al. 2021)。

有限公司结论和建议

根据目前可获得的科学证据，本研究没有找到令人信服的证据，证明在目前的暴露条件下，由于多种物质的综合暴露低于其单独的HBGV，人类健康处于危险之中，从而反驳了"反叛侏儒"的假设。如果目标组织中确实存在一种浓度足够高的“增强物质”，并与“驱动物质”共同发生，原则上可能会发生“邪恶的协同作用”。但是，如果可以获得足够的信息，则可以通过对增强剂和驱动剂作为单个物质进行适当的风险管理来防止这种情况。根据“多头龙”原理作用的物质通过影响相同靶细胞中的相同分子机制可能产生叠加作用，如二恶英类物质所报道的那样。这一观察结果强调了阐明导致不良结果的分子机制以及研究化合物的毒性动力学的重要性。

基于上述数据和描述的混合物毒性原理，我们得出结论，现有证据既不支持额外的通用安全系数的要求，也不支持通用MAFs的要求。尽管有必要对可能造成混合效应的物质进行更系统的审查和筛选，但证据的权重表明，当人类接触低于单个物质的HBGV时，引起人类健康关注的混合效应可能很少。更确切地说，对于PoD与当前暴露之间比率相对较低的物质，需要进行有针对性的风险评估;当这些物质具有共同的分子机制或相互作用时，这一点就更加重要了。因此，为了保护一般人群以及高暴露亚人群，我们建议将资源用于相对低暴露边际(MoE, POD与预测或估计人类暴露水平的比率)或RCR物质的风险评估。

对未来研究的一项建议是，应该改进对人类接触到的物质的概述。这将导致对来自不同来源的所有物质的全面概述，例如食品，环境和工作场所，这些物质通常由不同的专家小组管理。这种概述应包括有关人群、乙型肝炎病毒和荚膜病毒暴露的信息，负责毒性和毒性动力学的分子机制，包括有关受影响细胞类型的信息。通常，主要障碍是缺乏基于REACH标准信息要求的此类化学品的可靠暴露信息，这妨碍了可靠的RCR或MoE计算，并且需要使用可能导致严重高估风险的最坏情况假设。因此，应强制性提供更准确的使用和暴露信息。

新的方法将有助于筛选和确定关注物质的优先次序。特别是，将毒性动力学分组到cag中并结合共暴露评估将是识别具有潜在协同效应的物质的有用工具。此外，还应全面汇编目前所有关于靶器官/靶细胞类型和毒性分子机制的知识。如果物质共享相同的靶器官并起作用，例如，通过相同的核受体或通过抑制相同的载体，则加性效应似乎是可能的。在这种情况下，可以实施目前成功应用于类二恶英物质的TEF概念，即使这些物质不属于同一物质类别。因此，它可以应用于通过相同分子机制作用于相同靶细胞的物质。

总之，考虑到现有的科学证据，无论是现有的概念数据还是体内实验，几乎没有任何支持通用混合物评估/分配因素的论据。这并不是说混合毒性不会对特定物质和暴露情况构成风险，特别是在司机在场的情况下。然而，鉴于上述概念，似乎值得怀疑的是，这些是最好的处理一般。相反，有必要采取更具体的数据驱动措施，以改进对低暴露边际或低风险表征比物质的评估。